300kd Hollow Fiber Ultrafiltration: Analysis Of A High-Efficiency Concentration And Purification Process For Foot-and-Mouth Disease O/A Virus
Sep 03, 2026| Introducción
La fiebre aftosa-- (FA) es una enfermedad animal aguda, febril y altamente contagiosa causada por el virus de la fiebre aftosa -y- (FADV). Este virus afecta a los animales ungulados-, con más de 70 especies susceptibles. Se propaga rápidamente y tiene una alta tasa de morbilidad, afectando típicamente al ganado mayor como cerdos, ovejas y vacas, donde la incidencia puede alcanzar el 100%. El virus de la fiebre aftosa pertenece al géneroVirus de la fiebre aftosa-y-de la familia MicroRNAviridae. Las partículas son esféricas, de aproximadamente 27 a 30 nm de diámetro, con un coeficiente de sedimentación de 146S para partículas virales intactas. Actualmente, se encuentran disponibles varias vacunas contra la fiebre aftosa, incluidas vacunas de virus vivos atenuados, vacunas de vectores de virus vivos, vacunas inactivadas, vacunas de ácido nucleico, vacunas de péptidos sintéticos y vacunas de subunidades. Las vacunas inactivadas contra la fiebre aftosa generalmente tienen menos efectos secundarios en los animales, y las vacunas multivalentes ofrecen una mayor eficacia de inmunización, lo que las convierte en el pilar de la prevención de la fiebre aftosa en China.
Ultrafiltración de flujo tangencial
Actualmente, la ultrafiltración de flujo tangencial es un método de purificación y concentración comúnmente utilizado en la producción a gran-escala de vacunas inactivadas multivalentes-contra la fiebre aftosa. Este método no sólo logra el factor de concentración deseado sino que también elimina una gran cantidad de impurezas extrañas. La ultrafiltración de flujo tangencial se utiliza principalmente para purificación, concentración y filtración (desalación y sustitución de tampón). Además, también se puede utilizar para la clarificación de caldo de fermentación o medio de cultivo celular mediante microfiltración de flujo tangencial, sustituyendo así a la centrifugación o clarificación primaria.
En la filtración vertical convencional, las moléculas grandes tienden a agregarse en la superficie de la membrana, obstruyendo el filtro. La filtración de flujo tangencial, sin embargo, permite que el flujo avance paralelo a la membrana, evitando este problema de obstrucción. Durante la filtración de flujo tangencial, el disolvente y las sustancias más pequeñas que el tamaño de los poros de la membrana que atraviesan la membrana se denominan permeado, mientras que las sustancias más grandes que el tamaño de los poros se retienen como concentrado. Combinado con procesos optimizados de lavado y filtración, se puede lograr la separación y purificación de moléculas de diferentes tamaños. Esta tecnología ofrece ventajas como bajo costo, condiciones de operación suaves, limpieza y reemplazo convenientes, alto caudal de permeado de membrana y operación simple, lo que la hace particularmente adecuada para la concentración y purificación a gran escala-de sustancias bioactivas.
Materiales y métodos
Columna de Fibra Hueca:Límite de peso molecular de 300 kd, área de membrana de 1600 cm².
Materiales:5,6 litros de cada uno de los sobrenadantes del virus de la fiebre aftosa tipo O y tipo A después de la centrifugación y clarificación.
Parámetros del proceso:Durante la concentración de ultrafiltración, la fuerza de corte se ajustó a aproximadamente 3000⁻¹ y la TMP se controló para que no fuera superior a 10 psi. Cuando el factor de concentración se acercó a 11 veces, la muestra se lavó con solución tampón 6CV. Después del lavado, se introdujo aire estéril en el tubo de entrada y toda la muestra concentrada en el tubo se inyectó en la botella de concentración de muestra. Luego, se añadió PBS estéril para enjuagar el tubo hasta que el volumen final del líquido concentrado fue de 500 ml, mejorando así la tasa de recuperación general.
Resultados y discusión
En términos de purificación inicial de virus, la concentración de ultrafiltración logra una tasa de eliminación de más del 90% de impurezas como proteínas que no contienen virus. En términos de volumen, puede alcanzar altas concentraciones de 10 a 50 veces, lo que proporciona un fuerte apoyo para la purificación posterior. Se selecciona una columna de fibra hueca con un límite de peso molecular de 300 kd. Este tamaño de poro, si bien retiene más del 85% del virus, puede eliminar más del 90% de las proteínas impurezas. El área de la membrana es de 1600 cm² y el rendimiento es de 2 a 5 ml/cm², lo que permite completar la concentración de ultrafiltración en un tiempo efectivo (en 2 horas). Los datos detallados de concentración y purificación de ultrafiltración se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Resultados de detección total de antígenos de fiebre aftosa-y-(tipos O y A)
| Nombre de la muestra | Alimentación líquida | Volumen (ml) | Contenido de 146S (ug/mL) | Tasa de recuperación del 146S (%) | Concentración de proteína (ug/mL) | Tasa de eliminación de proteínas (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| O-tipo | Solución original | 5600 | 2.53 | 87.94 | 5040 | 94.38 |
| O-tipo | Concentrarse | 500 | 24.92 | 87.94 | 3170 | 94.38 |
| Un tipo- | Solución original | 5600 | 3.37 | 94.80 | 5980 | 93.55 |
| Un tipo- | Concentrarse | 500 | 35.78 | 94.80 | 4318 | 93.55 |
Consideraciones sobre el método de purificación
Actualmente, existen varios métodos de purificación, pero incluso con el mismo método para el mismo antígeno, el efecto de purificación suele ser insatisfactorio por muchas razones, incluida la caracterización del antígeno y los parámetros del proceso. Por ejemplo, los cambios en el diseño molecular aguas arriba o en los sistemas de cultivo de fermentación pueden alterar la estructura molecular viral, lo que lleva a resultados de purificación insatisfactorios. Los métodos de clarificación inadecuados pueden aumentar los costos de materia prima o la cantidad de proteína heteróloga, aumentando la presión sobre la purificación posterior. Una concentración de ultrafiltración inadecuada, como diferentes tamaños de poro de la membrana de ultrafiltración, factores de concentración y elución, tasas de flujo de entrada, tasas de filtración y TMP, pueden dar como resultado tasas bajas de recuperación de antígeno. Una amplia práctica muestra que una mala purificación puede provocar importantes reacciones adversas en los animales después de la inmunización, pudiendo provocar la muerte.
Conclusión:Este estudio muestra que, en procesos de flujo tangencial, al seleccionar el tamaño de poro de la membrana apropiado (300 kd), la relación de lavado, el caudal de entrada y el TMP, se puede garantizar una alta tasa de recuperación y una máxima eliminación de impurezas.