Filtración de flujo tangencial TFF combinada con ultracentrifugación para una preparación eficiente de vesículas extracelulares pequeñas
Aug 28, 2026| Las pequeñas vesículas extracelulares (sEV) son vesículas a nanoescala secretadas por células que contienen ácidos nucleicos, proteínas, moléculas pequeñas y otros componentes, y desempeñan un papel importante en la comunicación intercelular. Las pequeñas vesículas extracelulares de tipo exosoma- comparten grandes similitudes con sus células madre. En comparación con las nanopartículas artificiales, exhiben tasas de eliminación inmune más bajas y una citotoxicidad más baja, lo que las convierte en candidatos prometedores como novedosos.vehículos de administración de fármacos in vivo. Casi todos los tipos de células pueden secretar estas vesículas, y la investigación sobre su aplicación como transportadores de fármacos está avanzando gradualmente desde el laboratorio hacia aplicaciones clínicas. Sin embargo,la producción a gran-escala sigue siendo un obstáculo importante.
Métodos actuales para el aislamiento de vesículas extracelulares
Los métodos actuales de aislamiento de vesículas extracelulares incluyenultracentrifugación, centrifugación en gradiente de densidad, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y precipitación con polietilenglicol (PEG).
La precipitación con PEG ofrece un alto rendimiento y un funcionamiento sencillo, pero se asocia con una contaminación significativa por proteínas no deseadas. La centrifugación en gradiente de densidad y la cromatografía de exclusión por tamaño-pueden proporcionar productos de alta-pureza, pero su eficiencia es relativamente baja y los procesos consumen mucho tiempo-. La ultracentrifugación se utiliza ampliamente, pero su volumen de procesamiento está limitado por la capacidad de la centrífuga, lo que dificulta su ampliación.
Aplicación de la filtración de flujo tangencial para la separación de sEV
La filtración de flujo tangencial (TFF) ya se ha aplicado a la separación de nanopartículas como liposomas y vectores lentivirales. En TFF, la alimentación fluye tangencialmente a través de la superficie de la membrana, lo que ayuda a reducir la contaminación de la membrana y facilita la ampliación del proceso.
Dado que las pequeñas vesículas extracelulares generalmente varían desde30-200 nanómetrode diámetro, unCasete de membrana de 0,45 μmse puede seleccionar en el sistema TFF para eliminar proteínas y vesículas más grandes, mientras que unCasete de membrana de 300 kDase puede utilizar para eliminar proteínas de pequeño peso molecular-y concentrar las pequeñas vesículas extracelulares presentes en el medio de cultivo.
Caracterización de la Materia Prima después de la Separación de TFF
El análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) mostró que los diámetros de las partículas se distribuían principalmente dentro del rango de0-250 nanómetro.
Sin embargo, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló una gran cantidad de proteína contaminante, mientras que no se observaron vesículas extracelulares. Estos resultados indicaron que se requería un paso de purificación adicional para purificar aún más las vesículas extracelulares.
Caracterización del concentrado de TFF después de la ultrafiltración de 100 kDa.
El concentrado de TFF se procesó adicionalmente utilizando unTubo de ultrafiltración de 100 kDa..
NTA demostró que los diámetros de partículas en los concentrados obtenidos después de una y dos rondas de ultrafiltración se mantuvieron principalmente dentro del rango de0-250 nanómetro. Sin embargo, realizar la ultrafiltración dos veces dio como resultado una reducción significativa en el número de partículas obtenidas.
El análisis TEM mostró que no se observaron estructuras similares a vesículas-en los concentrados de ultrafiltración de una-o dos-veces, mientras que permaneció una cantidad considerable de proteína contaminante.
Por lo tanto,La ultrafiltración de 100 kDa no se pudo utilizar eficazmente para purificar el medio de cultivo después de la concentración de TFF.
Caracterización del concentrado de TFF purificado por ultracentrifugación
NTA mostró que los diámetros de partículas de los productos purificados se distribuyeron principalmente dentro del rango de0-250 nanómetro.
Es importante destacar que TEM reveló claramente estructuras en forma de vesículas-en diferentes campos de visión. Estos resultados demostraron que después de concentrar el medio de cultivo usando TFF,La ultracentrifugación se puede emplear posteriormente para una mayor separación y purificación de vesículas extracelulares..
Caracterización de sEV aislados de medio acondicionado con células madre mesenquimales utilizando TFF combinado con ultracentrifugación
NTA mostró que los diámetros de partículas de los productos purificados se distribuyeron principalmente dentro del rango de0-250 nanómetro.
Mediante TEM se observaron estructuras similares a vesículas-. El análisis de transferencia Western demostró una expresión positiva de las proteínas asociadas a la vesícula extracelular-CD9, CD63 y ALIXen las vesículas extracelulares purificadas.
Estos resultados confirmaron que las pequeñas vesículas extracelulares purificadas contenían exosomas, lo que indica que este método también se puede utilizar paraaislamiento y extracción de exosomas.
Conclusión: TFF combinado con ultracentrifugación para una preparación de sEV de alta-calidad
El estudio demostró queConcentración de TFF soladio lugar a un producto que contenía una cantidad considerable de proteínas contaminantes y, por tanto, era insuficiente para obtener vesículas extracelulares cualificadas.
Asimismo, utilizando unTubo de ultrafiltración de 100 kDa para purificación secundaria.no produjo efectivamente estructuras de vesículas intactas.
Combinando la concentración de TFF con la posterior purificación por ultracentrifugación, se pueden integrar las ventajas de ambas técnicas para obtenerproductos de vesículas extracelulares pequeñas de alta-calidad.
En comparación con la ultracentrifugación convencional sola, el proceso combinado puede efectivamentereducir el tiempo total de procesamiento y mejorar la eficiencia de separación.
En este flujo de trabajo,TFF permite un enriquecimiento rápido de muestras de gran-volumen, abordando la limitación de la ultracentrifugación convencional en el procesamiento de grandes volúmenes de muestras. Luego, la ultracentrifugación realiza una purificación profunda para eliminar las impurezas de proteínas co-concentradas y, al mismo tiempo, ayuda a mantener la pureza y la integridad de las vesículas.
Además, el proceso no requiere la adición dereactivos de precipitación química exógena, ayudando a preservar al máximo la actividad biológica de las vesículas.
Desde la perspectiva de la traducción industrial, este proceso tiene importantesampliar-el potencialy puede ayudar a abordar los desafíos asociados con la producción a gran-escala de vesículas extracelulares paraadministración de medicamentos, medicina regenerativa y desarrollo de productos relacionados. También proporciona una base experimental sólida para la posterior optimización de procesos y fabricación a escala piloto-.
Referencia
Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha y otros.Establecimiento de un método para la separación de pequeñas vesículas extracelulares mediante filtración de flujo tangencial combinada con ultracentrifugación. Revista china de productos biológicos, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.